Fu, B., Brock, E. E., Andrews, R., Breiter, J. C., Tian, R., Toomey, C. E., Lachica, J., Lashley, T., Ryten, M., Wood, N. W., Vendruscolo, M., Gandhi, S., Weiss, L. E., Beckwith, J. S., Lee, S. F. “RASP: Optimal Single Puncta Detection in Complex Cellular Backgrounds.” J. Phys. Chem. B 2024, 128, 3585−3597. https://doi.org/10.1021/acs.jpcb.4c00174
背景
単一分子および超解像顕微鏡法は、複雑な生物学的システムの観察範囲を大幅に拡大してきた。特に、Moonらの研究では、超解像とスペクトルイメージングの組み合わせにより、30 nmの空間解像度で生きた哺乳類細胞の異質性を明らかにし、オルガネラおよび細胞膜の化学的極性の違いをコレステロールレベルの違いとして示した。また、DeguchiらはMINFLUX技術を用いて、リビングセル内でキネシン-1モータータンパク質が微小管上を移動する際の8 nmのサブステップを観察した。さらに、ReinhardtらはDNAバーコーディング手法を用いて、超解像法の空間解像度をÅレベルまで向上させ、全細胞内でのバイオ分子の観察およびDNA骨格内の単一塩基間の距離を分解することに成功した。これにより、超解像顕微鏡法と構造生物学の長さスケール間のギャップが縮まり、正確な構造理解が生きた細胞および複雑な組織にもたらされる可能性が開かれた。これらの手法はすべて、単一の蛍光スポットまたはプンクタの検出に依存しており、弱い信号でも検出するための多くの努力が払われている。
さらに、単一の蛍光プンクタの識別に加えて、大規模な周囲の細胞環境も同時に検出することが有利である。これにより、研究者は単一の分子（タンパク質、DNA、RNAなど）を調査するだけでなく、それらの環境内での相互作用および局在を理解することができる。例えば、単一分子蛍光原位ハイブリダイゼーション（smFISH）技術は、生物学的環境内でRNAを視覚化することを可能にし、RNAが単一の明るい蛍光プンクタとして検出され、細胞または細胞内環境が同時にイメージングされる。smFISHはRNAの局在および追跡の理解を大幅に向上させ、Allen Brain Atlasプロジェクトなどの大規模マッピングプログラムに依存する技術の一つとなっている。
従来の問題点
しかし、これらの実験には背景を正確に検出および補正するという根本的な課題が存在する。多くの従来の単一分子および超解像実験では、サンプル選択および準備が不要な背景信号を最小限に抑えるように選ばれることが一般的である。背景信号は、エミッタや散乱体からの不要な光子や、ターゲット分子/プロセスに関連しないカメラ読み出しノイズの組み合わせであり、これがプンクタ検出を困難にしている。
解決方法と結果
そこで、本研究ではRASP（Radiality Analysis of Single Puncta）を提案し、この問題を解決した。RASPはバイオイメージングセグメンテーション手法であり、他の解析方法が検出する誤検出プンクタを除去し、単一タンパク質から複雑な細胞表現型まで広範な空間スケールで特徴を検出する。RASPは、画像の勾配を使用してガウス形状のオブジェクトを背景から分離することで、最先端の方法よりも精度と速度で優れていることを示した。人間の脳におけるミクログリア、ニューロン、およびα-シヌクレインオリゴマー間の空間相関を抽出することで、RASPの能力を実証した。この感度が高く計算効率の高いアプローチにより、細胞および組織環境内で蛍光プンクタおよび細胞特徴を区別することが可能となり、単一タンパク質レベルの感度まで達成した。
Cobolt社製のレーザーは、これらの実験において、特に488 nmおよび561 nmのレーザーを用いて蛍光照明を行うために使用された。これにより、背景信号を最小限に抑えつつ、対象の蛍光シグナルを効果的に励起することができた。
使用されたCoboltのレーザー
