Pixel-reassigned line-scanning microscopy for fast volumetric super-resolution imaging

高速ボリューム超解像イメージングのためのピクセル再割り当てラインスキャン顕微鏡

Hongjin Li, Gan Liu, Qiuyuan Zhong, Shih-Chi Chen

1. 従来技術の長所

超解像顕微鏡は、生物フォトニクスの分野で3D生物構造の詳細を明らかにする技術として急速に研究が進められている。例えば、単分子局在イメージング技術である確率的光学再構成顕微鏡（STORM）や光活性化局在顕微鏡（PALM）、および刺激発光減衰顕微鏡（STED）などが、ナノメートル単位のイメージング解像度を達成している。しかし、これらの技術は低速のイメージング速度と光毒性の問題があり、長期間の大規模な高速超解像イメージングには制限がある。一方、構造化照明顕微鏡（SIM）は、より高い光子効率、イメージング速度、および低光毒性を持ち、適度な解像度向上を実現している。従来のSIMは、高周波情報を含む複数の位相シフト構造画像を生成し、干渉を通じて異なる方向から取得することで超解像画像を再構成する。これにより、厚いまたは密な生物試料における高背景信号やノイズの問題を解決するための技術が進化してきた。

2. 従来技術の問題点

しかし、従来のSIMでは、TIRF-SIMやGI-SIMのような技術が使用されるが、これらは表面に限定された照明を利用しており、イメージング深度に制約がある。また、LiMoやHiLoアルゴリズムのような背景除去方法も有望な結果を示しているが、解像度は回折限界に制約される。さらに、従来のISMシステムはシリアルスキャン構成（例えば、ガルバノミラーを使用）であり、低速なイメージング速度に悩まされている。これを解決するために、デジタルマイクロミラーデバイスやスピニングディスクを利用した並列スキャンISMが開発されたが、計算の複雑さが増し、複数の中心位置を特定する必要があるため、リアルタイム処理が困難になる問題がある。

3. 解決方法の提案と結果

そこで、本研究では、ピクセル再割り当てラインスキャン顕微鏡（PRLM）を提案し、大規模な3D超解像イメージングを実現した。記録されたライン画像を各スキャン位置のライン照明中心に再割り当てして解像度を向上させ、次にHiLoアルゴリズムを適用して背景信号を除去する。この簡単な設計により、PRLMは密度の高い厚い生物試料の超解像イメージングに適した容易でコンパクトな低コストのソリューションとなる。

シミュレーションと実験の結果、PRLMは0.41 µmの解像度と3400ピクセル/ミリ秒のイメージング速度を達成した。シミュレーションと実験により、蛍光ビーズのPSFが評価され、U-2 OS細胞や花粉粒などの生物試料の3Dイメージング能力が実証された。これらの結果は、PRLMが大規模生物試料の超解像可視化に適した強力なツールであることを確認した。

仕様: Cobolt社のCalypsoTMレーザー発振器（491 nm連続波レーザー）は、本研究で使用された。